湖南大学韩晓筱课题组《Nature Communications》：新型光散射抑制机制助力高保真光固化生物3D打印

光固化生物3D打印技术（如：数字光处理，DLP）可精确控制细胞和生物材料在空间中的分布，以此构建复杂几何结构，被广泛应用于组织工程、药物筛选、外科植入物等生物医学研究领域。然而，在DLP打印过程中，光在固液两相界面会产生物理散射，细胞的混入会加剧此种散射效应，导致水凝胶在非目标区域固化，降低了打印精度，使众多生物性能优异且具有小尺度特征（如血管网络和薄壁结构等）的复杂结构难以成型，限制了DLP打印技术在生物医学领域的应用。针对这一挑战，湖南大学机械与运载工程学院韩晓筱教授等提出了一种光吸收与自由基反应协同作用的光散射抑制新机制，并基于此机制开发了一种新型光抑制剂（Curcumin-Na，Cur-Na），降低了载细胞水凝胶光固化打印过程中的光散射效应，将打印精度提高到1.2-2.1像素点，几何误差低于5%，成功制造了各种具有多尺度通道和薄壁网络结构的生物活性功能支架。此外，该方法具有较宽的打印参数窗口，极大地缩短了参数优化过程。相关研究成果以题为"Photoinhibition via simultaneously photoabsorption and free-radical reaction for high-fidelity light-based bioprinting"的文章发表在《Nature Communications》（SCI一区，Top期刊，IF=17.69）。湖南大学博士研究生贺宁为第一作者，湖南大学机械与运载工程学院韩晓筱教授和陈锋副教授为通讯作者。

水凝胶生物墨水中传统的光吸收剂能够吸收过量的光能量，防止打印层厚过厚，从而在一定程度上提高垂直方向上的打印精度。然而，传统的光吸收剂难以解决由光散射引起的水平方向上过固化的问题。因此，该研究提出了光吸收与自由基反应协同作用的光抑制机制：保留传统光吸收剂功能的同时并能“抢夺”水平方向上散射光激发的自由基，抑制散射区域的自由基与水凝胶发生聚合反应，防止非目标区域的固化，从而提高水平方向上的打印精度和保真度。基于此机制，该团队首先成功开发了一种新型光抑制剂（Cur-Na）（如图1），其具有良好水溶性和生物相容性。接着，该团队制备了含不同光抑制剂的PEG-GelMA生物墨水，通过研究生物墨水的物化性质评价了其可打印性和机械性能（如图2）。然后通过理论和实验研究聚合过程，揭示了Cur-Na减轻散射效应的机制（如图3）：Cur-Na的吸收峰位于425nm附近，非常接近光源波长，可以作为典型的光吸收剂降低光穿透深度。同时，Cur-Na 可以通过更高的反应速率竞争性地抢夺自由基来阻止水凝胶单体聚合形成固化水凝胶。再者，Cur-Na 的反应产物为液体，避免了非目标区域的固化。由于 Cur-Na 的高反应性速率，固定浓度的 Cur-Na 可以在很宽的光强度范围内抑制散射效应，避免在打印不同结构的时，打印参数再次优化，提高打印效率。文章中，图4和图5定量研究了加入Cur-Na后的生物墨水的打印分辨率和图案保真度，以验证Cur-Na在解决光散射效应方面的有效性。之后，团队将添加了Cur-Na的生物墨水应用到摩方精密 microArch S140光固化打印机中，成功地制造了各种复杂结构体（仿生支架，可灌注血管网络，极小三周期曲面等），证明了该光抑制剂在制造具有小尺度特征的功能性载细胞三维支架方面的卓越能力（如图6）。图7进一步证明了此生物墨水在组织工程中的适用性。

图1. 姜黄钠的合成。a. 用姜黄素和碳酸氢钠合成姜黄素钠（Cur-Na）的过程。姜黄素分子中酚羟基的H+被Na+取代（红色椭圆），而姜黄素中的羰基键发生酮-烯醇互变异构（蓝色椭圆）。b. 姜黄素和Cur-Na的1H-NMR光谱，显示了合成过程中发生的化学性质的代表性变化。蓝色阴影区域表示酚羟基的特征共振（δ=9.65ppm）。绿色阴影是烯烃信号（δ=5.93ppm），表明C=C双键的形成。

图2. 生物墨水的物化性质。添加了不同浓度光抑制剂的生物墨水（PEG-GelMA/LAP）的储能模量（G'反映材料的刚度）和损失模量（G''反映材料粘度）随时间的变化：a.柠檬黄和b. Cur-Na。G'和G'之间的交叉点被称为凝胶点，而凝胶时间被定义为曝光开始至凝胶点的时间（在该研究中约为20秒）。生物墨水在405nm、13mW cm−2的光照下曝光30s。阴影区域表示曝光时间。c. 水凝胶的应力-应变曲线。d. 三种水凝胶在~20%应变下的弹性模量。三种生物墨水的e. 溶胀比和f. 溶胶分数对比。

图3. Cur-Na抑制散射效应的机制。a. 示意图显示了当光穿透生物墨水时光强的高斯分布以及不同情况下产生的固化区域，包括无散射、有散射、与细胞混合的生物墨水和添加Cur-Na的生物墨水。Cd和Cw分别是固化深度和固化宽度。E0表示生物墨水表面的光强度，而EC是引发聚合所需的临界能量。b. Cur-Na自由基链生长聚合的动力学过程由三个阶段控制：（1）引发、（2）链传播、（3）（4）终止。ki，kp，ktc和ktd分别是四种反应中的速率常数。每个Cur-Na与三个自由基（R·）反应，引发聚合物链生长，形成单体（M）。激活后的单体可以与其他单体反应，聚合物链通过传播而增长，形成Mn·和Mm·。当链传播通过终止反应终止时，形成聚合物（Mn和Mm）。c. Cur-Na和PEGDA聚合过程中官能团的转化率与时间的关系。散射区域的自由基可以被Cur-Na快速消耗；水凝胶单体由于缺乏自由基而难以在散射区域形成聚合物。

图4. 水平方向打印精度分析。a. 辐条状图案用于评估打印精度，从中心到外围相邻辐条之间的间隙增加。打印精度被定义为模糊区域直径（红色虚线圆圈）与辐条状图案直径的比值。b. 载细胞结构的荧光染色图。c. 打印结构的显微图像，显示了纯PEG-GelMA生物墨水（上）和添加了柠檬黄（中）和Cur-Na的生物墨水（下）的模糊区域（红色虚线圆圈）大小与相对曝光能量的关系。Er指相对能量，定义为实际光能与单位曝光量的比。d. 模糊区域大小与曝光能量的定量关系。e. Cur-Na的高精度打印窗口，灰色、红色、蓝色区域分别代表含1mM、2mM、3mM Cur-Na生物墨水的打印窗口宽度。f. 载细胞打印结构的模糊区域大小与曝光能量之间的定量关系。

图5. 多层打印中的中空通道打印性分析与评定高保真度的打印误差分析。a. 具有不同直径（D=300、500和700μm）通道的圆柱体的3D CAD设计。H表示圆柱体的高度，而h1、h2和h3是通道的中空部分。打印精度定义为中空部分与通道总长度之间的比率。b. 连续层打印中的散射效应及其引起的过固化现象。c-e. 打印精度随圆柱体直径的高度和通道直径的关系。f. 具有不同直径的多通道结构CAD设计。g. 分别使用含Cur-Na和柠檬黄的生物墨水打印的样品。h. 通道的实际直径与设计直径间的差异。

图6. Cur-Na在打印生物医学应用中常用的复杂三维结构时的分辨率和高保真度。a. 脊髓支架。它的结构特点呈现不规则的通道和薄壁网络，模仿脊髓的内部结构。使用两种类型的水凝胶成功地制备了支架：PEG-GelMA（10%）和甲基丙烯酸缩水甘油酯改性的丝素蛋白（Sil-MA（15%））。b. 具有多个分支、可灌注通道（200-800μm）和薄壁（~100μm）的血管网络。通过注射有色染料溶液进行灌注。c. 具有独特拓扑特征（曲面、高孔隙率和连通性）的gyroid支架。d. 打印载HepG2细胞的gyroid支架并培养14天，展现了良好的细胞增殖效果。

图7. 基于PC-12细胞体外培养的Cur-Na 细胞相容性评价。a. 细胞活死染色荧光图展示了细胞14天的活力（绿色：活细胞；红色：死细胞）。b. CCK-8测定细胞增殖情况。细胞在支架中增殖14天，PEG-GelMA/Cur-Na水凝胶中的细胞展现出最好的增殖效果。c. 使用PEG-GelMA/Cur-Na水凝胶制造的通道支架（直径200μm）的荧光图像显示了均匀的细胞分布。最后一张图像显示了细胞沿着通道的生长情况。d. 第1、7和14天脊髓支架中通道的共聚焦图像。e. 荧光图像显示种植在PEG-GelMA/Cur-Na支架表面的PC-12细胞的分化和突起形成（第7天）。Tuj-1：Beta3-微管蛋白；DAPI：4’，6-二胺基-2苯基吲哚。

结论

该研究提出了一种光吸收和自由基反应协同作用的光抑制新机制，有效抑制光辅助3D打印中的光散射效应。基于此机制，开发了一种新的光抑制剂（Cur-Na），具有以下独特优势：（1）显著提高打印分辨率和保真度：在限制水凝胶的溶胀下，打印精度可接近打印机理论极限（~1像素）；（2）具有良好打印参数适应性，极大简化了打印参数优化过程；（3）在制造具有微尺度通道和薄壁等复杂支架结构上展现出卓越能力，对于支架内营养物质的运输和氧气的渗透具有重要意义；（4）能成功制造对光散射效应尤其敏感的载细胞Gyroid支架，且在历经14天的培养后，支架内细胞展现出良好的增殖态势。（5）此方法可应用于其他由自由基链生长聚合控制的可光固化墨水中（例如Sil-MA等）。该研究提供的将多尺度特征直接赋予组织结构的方法，对于更好地模拟天然组织微环境至关重要。研究中确立的策略提高了生物3D打印高保真复杂结构的可打印性和可操作性，从而助力更先进的组织工程和再生医学应用的实现。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-38838-2